PBIS – nowy biomarker w terapii raka wątrobowokomórkowego

HCC w świetle najnowszych odkryć?

Hepatocellular carcinoma (HCC) jest trzecią wiodącą przyczyną zgonów związanych z nowotworem i szóstym najczęściej diagnozowanym nowotworem na świecie według globalnych statystyk nowotworowych z 2020 roku. Zaawansowane stadium HCC charakteryzuje się obecnością zakrzepicy żyły wrotnej (PVTT) lub rozsiewem pozawątrobowym. W przypadku nieresekcyjnego HCC leczenie systemowe jest pierwszym wyborem, począwszy od wprowadzenia sorafenibu, doustnego inhibitora wielokinazowego, w 2007 roku.

Atezolizumab jest lekiem ukierunkowanym na ligand programowanej śmierci 1 (PD-L1), który wzmacnia przeciwnowotworową odpowiedź immunologiczną poprzez zapobieganie hamowaniu aktywności limfocytów T zależnej od PD-L1. Bevacizumab jest inhibitorem angiogenezy ukierunkowanym na czynnik wzrostu śródbłonka naczyniowego (VEGF), który blokuje angiogenezę guza, hamując tym samym wzrost guza i przerzuty. W kluczowym badaniu klinicznym III fazy IMbrave150, kombinacja atezolizumabu z bevacizumabem (AB) wykazała znaczącą poprawę mediany przeżycia całkowitego (OS; 19,2 vs 13,4 miesiąca, p<0,001) oraz mediany przeżycia wolnego od progresji (PFS; 6,8 vs 4,3 miesiąca, p<0,001) w porównaniu z sorafenibem, ustanawiając terapię AB jako standardowe leczenie pierwszej linii w nieresekcyjnym HCC.

Czy cytokinowe biomarkery zmieniają obraz terapii HCC?

Przeanalizowano różne biomarkery z parametrów krwi, markerów tkankowych i badań obrazowych w celu przewidywania wyników terapeutycznych kombinacji AB. Dane z próbek krwi obejmowały markery zapalne, markery nowotworowe, komórki immunologiczne i cytokiny. Są one łatwo dostępne w praktyce klinicznej i oferują praktyczne zalety w porównaniu z innymi biomarkerami. W odniesieniu do leczenia AB, badano biomarkery krwi takie jak alfa-fetoproteina (AFP), czynnik wzrostu śródbłonka naczyniowego (VEGF), stosunek neutrofilów do limfocytów (NLR), białko C-reaktywne (CRP) i albumina. Ostatnio badania wykazały, że wyższe wyjściowe poziomy IL-6 w surowicy są związane z gorszymi wynikami klinicznymi leczenia AB, sugerując, że cytokiny w surowicy mogą służyć jako biomarkery dla leczenia AB w HCC. Niemniej jednak, podobnie jak w przypadku wielu kohort poddawanych leczeniu AB, konieczne jest badanie i weryfikacja cytokin związanych z ich różnorodnością.

Cytokiny są białkami przenoszącymi sygnały, zaangażowanymi w interakcje międzykomórkowe, które są rozpuszczalne we krwi, co czyni je łatwymi do wykrycia. Jako modulatory immunologiczne, zarówno immunosupresyjne, jak i immunostymulujące, są zaangażowane w regulację aktywności komórek immunologicznych i formowanie komórek nowotworowych. Cytokiny obejmują szeroką gamę rozpuszczalnych białek sygnałowych, w tym interleukiny (IL) i interferony (IFN), z których każdy wykazuje odrębne i różnorodne aktywności biologiczne. Interleukiny stanowią dużą rodzinę cytokin głównie zaangażowanych w regulację odpowiedzi immunologicznej i zapalnej poprzez modulowanie proliferacji, różnicowania, aktywacji i migracji komórek immunologicznych. Interferony, klasyfikowane jako typ I, II i III, głównie pośredniczą w działaniach przeciwwirusowych, antyproliferacyjnych i immunomodulujących, odgrywając kluczowe role w odporności wrodzonej i adaptacyjnej. Są one również zaangażowane w kliniczne stadia HCC i wywierają charakterystyczne i kluczowe efekty na mikrośrodowisko guza. Charakterystyczne cytokiny mogą działać jako biomarkery do przewidywania wyników leczenia systemowego. Oczekuje się, że biomarkery takie jak IL-6, angiopoetyna-2, TGF-β i VEGF mają wartość prognostyczną w terapii systemowej HCC.

W tym badaniu zbadano potencjał różnych cytokin w przewidywaniu wyników leczenia AB u pacjentów z nieresekcyjnym HCC. Poziomy cytokin w surowicy zebranej z prospektywnej kohorty zmierzono za pomocą macierzy cytokin Luminex. Zbadano ich związki z wynikami klinicznymi, takimi jak OS, PFS i odsetek obiektywnych odpowiedzi (ORR). Zbadano, czy cytokiny w połączeniu z ustalonymi markerami, takimi jak NLR i CRP, mogą służyć jako markery predykcyjne dla leczenia AB.

Zgoda etyczna na to badanie została uzyskana od Komisji Bioetycznej Katolickiego Uniwersytetu Korei, a badanie było prowadzone zgodnie z zasadami Deklaracji Helsińskiej. Prospektywnie zrekrutowano 116 pacjentów z nieresekcyjnym HCC otrzymujących leczenie AB w Szpitalu św. Marii w Seulu jako kohortę wyprowadzającą, oraz 54 pacjentów otrzymujących leczenie AB w Szpitalu św. Marii w Incheon jako zewnętrzną kohortę walidacyjną. Dodatkowo, 21 pacjentów otrzymujących leczenie lenvatinibem w Szpitalu św. Marii w Seulu zostało włączonych jako grupa porównawcza, aby ocenić specyficzność biomarkera. Pacjenci w wieku ≥18 lat z nieresekcyjnym HCC leczeni AB, z odpowiednią funkcją wątroby (klasa Child-Pugh A lub skompensowana B7), stanem ECOG 0-1, oraz dostępnymi wynikami badań cytokin wyjściowych uzyskanymi w ciągu jednego tygodnia przed rozpoczęciem leczenia byli prospektywnie włączani od maja 2020 roku. Pacjenci, którzy nie przeszli wyjściowych badań cytokin lub nie mieli wystarczających danych obserwacyjnych do oceny odpowiedzi, zostali wykluczeni. Wyniki kliniczne obserwowano przez okres do 4 lat lub do daty ostatniej wizyty kontrolnej. Od wszystkich uczestników uzyskano świadomą zgodę. Próbki surowicy pobrano przed rozpoczęciem leczenia.

Stężenia cytokin zostały oznaczone przy użyciu panelu MILLIPLEX MAP human cytokine/chemokine (Millipore, Niemcy) na urządzeniu Luminex 200 (Luminex, USA) zgodnie z wcześniej ustalonymi protokołami. Dane radiologiczne i laboratoryjne zostały zebrane w momencie włączenia do badania. Regularne obrazowanie przeprowadzano co 3-4 cykle AB, a skuteczność leczenia monitorowano przy użyciu zmodyfikowanych Kryteriów Oceny Odpowiedzi w Guzach Litych. OS i PFS mierzono od rozpoczęcia leczenia do śmierci, ostatniej wizyty kontrolnej lub progresji choroby. ORR obejmował odpowiedzi “całkowite” i “częściowe”, podczas gdy wskaźnik kontroli choroby obejmował całkowitą odpowiedź, częściową odpowiedź i stabilną chorobę.

Jak interpretować wyniki leczenia AB?

Analizy statystyczne przeprowadzono przy użyciu oprogramowania statystycznego R (wersja 4.0.3; R Foundation Inc., Austria) i SPSS (wersja 23.0; IBM Corp., USA). Zmienne ciągłe porównywano za pomocą testu t-Studenta, a zmienne kategoryczne analizowano za pomocą testu chi-kwadrat. Dopasowanie propensity score z dopasowaniem jeden do jednego najbliższego sąsiada w szerokości kalipera 0,20 zastosowano w celu złagodzenia różnic wyjściowych między grupami. Do analiz przeżycia zastosowano estymatory Kaplana-Meiera, a do określenia predyktorów wyników przeżycia zastosowano modelowanie regresji Coxa. Do identyfikacji determinantów odpowiedzi zastosowano regresję logistyczną. Istotność statystyczną ustalono na poziomie p<0,05.

Wyjściowe cechy kliniczne pacjentów zarówno w kohorcie wyprowadzającej, jak i walidacyjnej są podsumowane w Tabeli 1. Obie kohorty były ogólnie podobne pod względem profilu demograficznego i klinicznego, w tym wieku, rozkładu płci, obciążenia guzem i parametrów funkcji wątroby. Używając analizy korelacji rang Spearmana, najpierw zmierzono siłę związku między stężeniami różnych cytokin w surowicy a podstawowymi cechami wyjściowymi wśród wszystkich pacjentów. Poziomy interferonu gamma (IFN-γ) w surowicy dodatnio korelowały z wielkością guza wewnątrzwątrobowego (r = 0,199, p<0,05). Dodatkowo, IL-10 dodatnio korelowała z gorszym wynikiem Child-Pugh (r = 0,187, p<0,05) i poziomami markerów nowotworowych w surowicy, w tym AFP (r = 0,208, p<0,05) i białka indukowanego nieobecnością witaminy K-II (PIVKA-II) (r = 0,227, p<0,05). Ponadto wykazała silniejsze korelacje z wielkością guza wewnątrzwątrobowego (r = 0,376, p<0,001). IL-12 była dodatnio skorelowana z ECOG (r = 0,190, p<0,05), AFP (r = 0,247, p<0,05) i wielkością guza wewnątrzwątrobowego (r = 0,230, p<0,05), a IL-6 była dodatnio skorelowana z wielkością guza wewnątrzwątrobowego (r = 0,217, p<0,05). Poziomy IL-2 i czynnika martwicy nowotworu nie były związane z cechami klinicznymi. Wyniki te sugerują, że poziomy cytokin w surowicy mogą być podwyższone u pacjentów z wysokim obciążeniem guza.

Aby zidentyfikować markery zapalne we krwi obwodowej związane z wynikami klinicznymi, w tym PFS i OS, najpierw przeprowadzono jednowymiarowe analizy regresji Coxa dla cytokin, NLR i CRP. Analizy wykazały, że gorsze OS i PFS były istotnie związane z podwyższonym NLR i CRP, IL-12 i poziomami IL-2. Optymalne wartości odcięcia dla NLR, CRP, IL-12 i IL-2 zostały określone za pomocą regresji Coxa. Krótko mówiąc, wartości p z testu log-rank zostały obliczone dla wielu kandydatów na punkty odcięcia, a wartość odcięcia z najniższą wartością p została wybrana jako punkt optymalny. W rezultacie punkty odcięcia dla każdego markera zostały określone następująco: NLR≥3,5; CRP≥0,13 mg/dL; IL-12≥11,6 pg/mL; i IL-2≥3,2 ng/mL. Używając tych markerów, z których każdy miał przypisaną wartość 1 punktu, wygenerowano wynik PBIS, który wahał się od 0 do 4 punktów. Przy analizie czułości z użyciem regresji Coxa, PBIS≥2 miał najniższe wartości p dla OS i PFS, co było związane z gorszym PFS (HR = 2,10, CI = 1,31–3,36, p = 0,002) i OS (HR = 3,67, CI = 1,77–7,63, p = 0,001). Pacjentów, którzy spełniali powyższe kryteria, sklasyfikowano do grupy PBIS-wysokiej (PBIS^hi), a pozostałych do grupy PBIS-niskiej (PBIS^lo).

Dalej analizowano, czy grupy PBIS^hi i PBIS^lo, zdefiniowane powyżej, mogą reprezentować ogólne systemowe poziomy cytokin w surowicy i stężenia cytokin w surowicy (IFN-γ, IL-10, IL-12, IL-17, IL-2, IL-6 i TNF) u pacjentów leczonych AB. W rezultacie wszystkie cytokiny miały znacząco wyższe stężenia w surowicy wraz ze wzrostem PBIS (p<0,0001), sugerując, że wysokie poziomy PBIS mogą być istotnie związane z ogólnoustrojowym stanem zapalnym. Ponadto grupa PBIS^hi wykazała wyższe poziomy AFP, większy rozmiar guza wewnątrzwątrobowego i wyższy odsetek guzów mnogich, sugerując, że grupa PBIS^hi może mieć wyższe obciążenie guzem niż grupa PBIS^lo.

Aby przetestować znaczenie kliniczne PBIS, porównano ORR, OS i PFS między grupami PBIS^hi i PBIS^lo w kohorcie wyprowadzającej i walidacyjnej. W kohorcie wyprowadzającej grupa PBIS^hi wykazała znacząco niższy ORR niż grupa PBIS^lo (11/62, 17,7% vs. 20/54, 37,0%; p = 0,022). Ponadto grupa PBIS^hi miała gorsze wyniki dotyczące OS (HR = 3,59, p<0,001) i PFS (HR = 2,13, p<0,001) niż grupa PBIS^lo. Odpowiednio, niższy ORR w grupie PBIS^hi niż w grupie PBIS^lo (6/39, 15,4% vs. 8/15, 53,3%, p = 0,012) zaobserwowano w kohorcie walidacyjnej. Ponadto gorsze OS (HR = 4,01, p<0,001) i PFS (HR = 4,62, p<0,001) w grupie PBIS^hi były zgodne z tymi w kohorcie wyprowadzającej. Jednak kohorta lenvatinibu nie wykazała istotnych różnic w ORR, OS lub PFS między grupami PBIS^hi i PBIS^lo. Wyniki te sugerują, że PBIS może służyć zarówno jako biomarker predykcyjny, jak i prognostyczny dla leczenia AB.

Czy PBIS to klucz do poprawy przewidywania efektów immunoterapii?

W tym prospektywnym badaniu 170 pacjentów leczonych AB z powodu HCC, zbadano związek między wynikami klinicznymi a wyjściowymi markerami krwi obwodowej, w tym cytokinami surowicy, mierzonymi za pomocą wielokrotnego oznaczania cytokin. Wśród różnych zapalnych cytokin krwi obwodowej, pacjenci z wysokimi poziomami IL-2 i IL-12 wykazali gorsze OS i PFS po leczeniu AB. Włączając dwa znane markery obwodowe, NLR i CRP, stworzono PBIS, który wykazał silny związek między PBIS a wynikami klinicznymi. Poprzez analizę czułości, zdefiniowano wysokie PBIS jako podwyższone poziomy dwóch lub więcej z tych markerów. Grupa z wysokim PBIS miała znacząco gorsze OS, PFS i ORR zarówno w kohorcie wyprowadzającej, jak i walidacyjnej, co było odmienne od kohorty leczonej lenvatinibem. W kohorcie dopasowanej propensity score, grupa PBIS^hi wykazała istotne związki z gorszym OS, PFS i ORR, sugerując jej solidność jako biomarkera leczenia AB w HCC.

Immunoterapia poczyniła znaczące postępy i jest stosowana w pierwszej linii leczenia nowotworów, zwłaszcza HCC. Jednak brak wiarygodnych biomarkerów do przewidywania odpowiedzi klinicznych jest czynnikiem ograniczającym maksymalizację potencjału immunoterapii. Stres komórkowy, urazy, infekcje i stan zapalny prowadzą do produkcji i uwalniania cytokin. Te cytokiny odgrywają kluczowe role w regulacji aktywności komórek immunologicznych i wpływają na wszystkie etapy karcynogenezy. Ten bliski związek sugeruje, że cytokiny mają potencjał do służenia jako biomarkery leczenia HCC. Niedawne badanie 64 pacjentów leczonych AB z powodu HCC zidentyfikowało IL-6 w surowicy jako biomarker. Badanie wykazało, że wysokie poziomy IL-6 w osoczu były istotnie skorelowane z niskim wskaźnikiem odpowiedzi i krótszym PFS i OS. Wynik ten został dodatkowo zwalidowany przez inne badanie, które wykazało, że podwyższona IL-6 w surowicy była związana ze zmniejszonymi korzyściami klinicznymi z leczenia AB, co może być związane z supresją odpowiedzi limfocytów T. Jednak nasze badanie wykazało, że poziomy IL-6 nie były związane z wynikami klinicznymi, co wymaga dalszej walidacji tych wyników w przyszłych badaniach. Zaobserwowaliśmy, że grupa PBIS^hi wykazała ogólny wzrost poziomów zapalnych cytokin w surowicy, w tym IL-6, sugerując, że sam stan zapalny systemowy może przyczyniać się do zmniejszonego efektu immunoterapii w HCC.

Markery stanu zapalnego systemowego zostały uznane za wskaźniki predykcyjne skuteczności immunoterapii w HCC, przy czym NLR i CRP są znaczącymi biomarkerami. NLR jest stosunkiem liczby neutrofilów do limfocytów we krwi obwodowej, reprezentującym wrodzone i adaptacyjne systemy immunologiczne. Wysokie NLR jest związane z gorszymi wynikami klinicznymi u pacjentów leczonych terapią kombinowaną AB z powodu HCC. Inny marker, CRP, był badany w HCC ze względu na jego związek ze stanem zapalnym w karcynogenezie. W połączeniu z poziomem AFP dla systemu punktacji, jako wynik “CRAFITY”, pacjenci z HCC leczeni AB i niższymi wynikami wykazali lepsze OS, PFS i odpowiedź. Zamiast AFP, dodaliśmy cytokiny surowicy, w tym IL-2 i IL-12, oprócz NLR i CRP, a złożony system punktacji również istotnie przewidywał OS, PFS i odpowiedź, sugerując, że pomiar wyjściowych cytokin przed leczeniem powinien być brany pod uwagę w przyszłych badaniach biomarkerów.

Porównując nasz PBIS z innymi biomarkerami prognostycznymi, PBIS wykazał znacznie zwiększoną lub uzupełniającą zdolność do przewidywania wyników leczenia (ORR, PFS, OS) u pacjentów z nieresekcyjnym HCC otrzymujących AB. Ustalone indeksy, takie jak wynik CRAFITY (łączący CRP i AFP) i prostsze pojedyncze markery, takie jak NLR lub CRP, każdy wykazuje znaczącą wartość prognostyczną, ale wielowymiarowe podejście PBIS wydaje się je przewyższać. Co godne uwagi, PBIS przewyższył zarówno CRAFITY, jak i sam NLR w naszej kohorcie, wykazując silniejszy związek z wynikami leczenia. Na przykład, wysokie PBIS było związane z wyraźnie wyższym ryzykiem śmierci i progresji choroby niż wskazywał CRAFITY lub NLR (HR dla OS i PFS prawie ~1,5–2-krotnie większe). Pacjenci z wysokim PBIS (≥2 czynniki podwyższone) w naszej kohorcie osiągnęli ORR tylko ~17–18% vs. ~37% u pacjentów z niskim PBIS i mieli znacznie gorsze przeżycie (HR dla OS ~3,6–4,0; HR dla PFS ~2,1–4,6 dla wysokiego vs. niskiego), przewyższając prognostyczne rozróżnienie zapewniane przez sam NLR lub CRAFITY. CRAFITY dodaje komponent obciążenia guzem (AFP) do stanu zapalnego (CRP), poprawiając pojedyncze markery. PBIS, z kolei, opiera się na tych koncepcjach, jednocześnie uwzględniając zaburzenie równowagi odporności wrodzonej (NLR), systemową odpowiedź zapalną (CRP) i kluczowe sygnały cytokin immunologicznych (IL-2, IL-12). Poprzez integrację tych różnorodnych biomarkerów, PBIS zapewnia bardziej holistyczne odzwierciedlenie stanu zapalnego i immunologicznego pacjenta. To wielowymiarowe podejście zapewnia większą dyskryminację prognostyczną niż jakikolwiek pojedynczy parametr – status wysokiego PBIS pozostał niezależnym predyktorem gorszego ORR, PFS i OS w analizach wielowymiarowych, nawet po uwzględnieniu czynników klinicznopatologicznych i przewyższył inne wyniki oparte na krwi w bezpośrednich porównaniach. Dlatego, podczas gdy CRAFITY i NLR oferują cenną wartość predykcyjną dla wyników leczenia AB, PBIS uzupełnia i przewyższa te markery, przechwytując zbieżny wpływ stanu zapalnego systemowego, tym samym bardziej wiarygodnie stratyfikując prawdopodobieństwo odpowiedzi i przeżycia pacjentów.

IL-2 jest kluczową cytokiną w nadzorze nowotworowym, jest zaangażowana w odporność wrodzoną i adaptacyjną oraz odgrywa kluczową rolę w proliferacji komórek naturalnych zabójców (NK) i limfocytów T. Przeciwnowotworowy efekt IL-2 objawia się aktywacją komórek NK i limfocytów T CD8⁺ poprzez wiązanie z receptorem IL-2 o niskim powinowactwie. Jednakże IL-2 wykazuje rolę immunosupresyjną, ponieważ indukuje aktywację komórek T regulatorowych (T_reg), które wyrażają receptor IL-2 o wysokim powinowactwie, co skutkuje efektem pronowotworowym. Stymulowane sąsiednie komórki T_reg indukują apoptozę komórek T efektorowych zależną od deprywacji cytokin, które odgrywają kluczową rolę w immunoterapii nowotworów, co skutkuje zmniejszoną systemową odpowiedzią immunologiczną, która może przyczyniać się do progresji choroby. Wcześniejsze badanie wykazało, że wysoki stosunek komórek T_reg do komórek T efektorowych był związany ze zmniejszoną odpowiedzią kliniczną u pacjentów z zaawansowanym HCC leczonych AB. Inne badanie wykazało możliwą wartość prognostyczną podwyższonych poziomów IL-2 w surowicy w nowotworach przewodu pokarmowego, prezentując złą śmiertelność, co jest zgodne z naszymi wynikami. Związek między podwyższonymi poziomami IL-2 a jego immunosupresyjną rolą w immunoterapii HCC wymaga dalszych badań.

IL-12 jest cytokiną prozapalną, która stymuluje proliferację komórek NK i limfocytów T CD8⁺, wraz z promowaniem różnicowania komórek T pomocniczych i ich prezentacji antygenowej. Ponadto IL-12 ma właściwości antyangionenne, co czyni ją optymalnym celem dla terapii nowotworowej. Jednakże IL-12 jest uważana za odgrywającą główną rolę w systemowej odpowiedzi zapalnej. Chociaż ogólnie uważa się, że ma efekty przeciwnowotworowe, wyjściowe podwyższenie tej cytokiny może odzwierciedlać stan zapalny systemowy, który może ograniczać wzmocnienie przeciwnowotworowych odpowiedzi limfocytów T przez immunoterapię u pacjentów z HCC.

Podsumowując, wykazaliśmy, że system punktacji PBIS wykorzystujący poziomy IL-2 i IL-12 w surowicy, oprócz NLR i CRP analizowanych na początku leczenia AB u pacjentów z HCC, może być kompetentnym biomarkerem prognostycznym i predykcyjnym dla wyników klinicznych. Ten nieinwazyjny marker oparty na krwi mógłby zostać zwalidowany w większej międzynarodowej kohorcie.

Podsumowanie

Badanie przeprowadzone na 170 pacjentach z nieresekcyjnym rakiem wątrobowokomórkowym (HCC) leczonych kombinacją atezolizumabu z bewacyzumabem (AB) doprowadziło do opracowania nowego systemu punktacji PBIS. System ten, oparty na poziomach interleukiny-2 (IL-2), interleukiny-12 (IL-12), stosunku neutrofilów do limfocytów (NLR) oraz białka C-reaktywnego (CRP), wykazał wysoką skuteczność w przewidywaniu wyników leczenia. Pacjenci z wysokim PBIS (≥2 podwyższone markery) osiągali gorsze wyniki w zakresie przeżycia całkowitego, przeżycia wolnego od progresji oraz odpowiedzi na leczenie. PBIS przewyższył dotychczasowe biomarkery prognostyczne, oferując bardziej kompleksową ocenę stanu immunologicznego i zapalnego pacjenta. Wyniki zostały potwierdzone zarówno w kohorcie wyprowadzającej, jak i walidacyjnej, co wskazuje na potencjał PBIS jako wiarygodnego, nieinwazyjnego biomarkera w terapii HCC.