ctDNA vs tkanka w HCC: zgodność i znaczenie prognostyczne maxVAF

Czy ctDNA może zastąpić biopsję tkankową w zaawansowanym HCC?

Rak wątrobowokomórkowy (HCC) stanowi trzecią przyczynę zgonów związanych z nowotworami na świecie i około 80% pierwotnych nowotworów wątroby. Wielu pacjentów diagnozuje się w stadium zaawansowanym, gdzie leczenie systemowe jest podstawą terapii. Jednak w przeciwieństwie do większości nowotworów, HCC nie wymaga biopsji tkankowej do postawienia rozpoznania, co utrudnia stosowanie medycyny precyzyjnej opartej na profilowaniu molekularnym guza.

Biopsja płynna (liquid biopsy) polega na analizie krążącego DNA nowotworowego (ctDNA) uwalnianego przez guzy do krwioobiegu. Może ona stanowić nieinwazyjną i bezpieczną alternatywę dla profilowania genomowego nowotworów i tym samym kompensować brak rutynowego profilowania tkankowego w HCC. Kluczowe pytanie brzmi: na ile informacje genetyczne z ctDNA odzwierciedlają te z tkanki nowotworowej?

Dotychczasowe badania oceniające zgodność wyników sekwencjonowania nowej generacji (NGS) między ctDNA a tkanką w HCC były ograniczone niewielką liczbą próbek i zawężonym zestawem badanych genów. W niniejszym badaniu przeanalizowano 130 pacjentów z zaawansowanym HCC, porównując wyniki NGS z ctDNA (Guardant360) i tkanki nowotworowej (Oncomine Comprehensive Assay), oraz oceniono kliniczne znaczenie ctDNA u pacjentów leczonych atezolizumabem i bewacyzumabem (atezo/bev) – aktualnym standardem pierwszej linii.

Jak przeprowadzono analizę zgodności ctDNA i tkanki?

Badanie objęło 130 pacjentów z zaawansowanym HCC leczonych w CHA Bundang Medical Center w Korei od czerwca 2020 do października 2022. Wszyscy pacjenci mieli dostępne próbki do analizy tkankowej NGS oraz odpowiednią objętość osocza do analizy ctDNA (mediana 2,5 mL). Krew pobierano bezpośrednio przed rozpoczęciem terapii systemowej pierwszej linii.

Próbki krwi przetwarzano zgodnie z protokołem Guardant360 Clinical Blood Collection Kit. Po izolacji osocza przez wirowanie, zamrożone próbki wysyłano do laboratorium Guardant Health w USA (certyfikat CLIA i CAP). ctDNA sekwencjonowano z głębokością około 15 000×, oceniając warianty SNV, insercje/delecje w 74 genach oraz rearanżacje i CNV w wybranych genach. Warianty somatyczne włączano do analizy, jeśli przekraczały zwalidowany próg detekcji (0,2% VAF dla SNV).

Tkankowe próbki guza (formalina/parafina) analizowano za pomocą Oncomine Comprehensive Assay: 4 próbki OCA v3 (161 genów), 126 próbek OCA plus (501 genów, w tym TMB). Sekwencjonowanie wykonano systemem Ion Torrent S5 XL z głębokością około 2414×. Do oceny zgodności wykorzystano tylko wspólne regiony docelowe obu paneli (70 094 pz dla OCA v3, 90 209 pz dla OCA plus), aby wyeliminować błąd systematyczny wynikający z różnic w projektach paneli.

Jaką zgodność osiągnięto między ctDNA a tkanką nowotworową?

Sekwencjonowanie ctDNA było skuteczne w 97,7% przypadków (127/130), a co najmniej jeden wariant niewspółsynonimiczny wykryto u 85,8% pacjentów (109/127). Warianty klinicznie istotne (tier II) zidentyfikowano u 74,8% (95/127), w tym potencjalnie możliwe do wykorzystania terapeutycznego (OncoKB level 3B) u 14,2% (18/127).

Najczęstsze mutacje w ctDNA dotyczyły genów TP53 (48,8%), CTNNB1 (22,8%) i TERT promoter (13,4%). Umiarkowaną częstość obserwowano dla ARID1A i PTEN (po 8,7%), PIK3CA (4,7%) oraz amplifikacji CCND1 i CCNE1 (po 5,5%). Porównanie częstości wariantów między ctDNA, sparowaną tkanką i grupą GENIE nie wykazało istotnych różnic statystycznych dla żadnego z genów.

Ogólna zgodność mutacji kluczowych genów wyniosła 72,6% czułości (95% CI: 62,9–80,6%) i 75,0% wartości predykcyjnej dodatniej (95% CI: 65,3–82,7%). W przeciwieństwie do tego, CNV wykazywały niższą zgodność: 33,3% czułości i 31,3% wartości predykcyjnej dodatniej. Najwyższą zgodność osiągnięto dla mutacji PTEN, KRAS i NRAS (100% czułości i wartości predykcyjnej dodatniej), choć KRAS i NRAS wykryto tylko u 1 pacjenta każdy. Wysoką zgodność obserwowano także dla TP53 (czułość 73,9%, wartość predykcyjna dodatnia 75,6%) i CTNNB1 (73,3% dla obu metryk).

Mutacje w TERT promoter wykazywały niską zgodność (czułość 25,0%, wartość predykcyjna dodatnia 29,4%), co może wynikać z wysokiej zawartości GC w regionie promotora utrudniającej sekwencjonowanie. Dla PIK3CA nie stwierdzono żadnych identycznych mutacji (czułość i wartość predykcyjna dodatnia 0%).

Jak odstęp czasowy między pobraniami wpływa na zgodność?

Czas między pobraniem tkanki a ctDNA znacząco wpływał na zgodność wyników. W całej grupie 69,9% próbek (86/123) pobrano z odstępem ≤1 roku, 26,0% (32/123) w odstępie 1–5 lat, a tylko 4,1% (5/123) >5 lat. Wartość predykcyjna dodatnia pozostawała względnie stabilna (72,2–78,9%) niezależnie od odstępu czasowego, jednak czułość stopniowo rosła wraz ze skracaniem odstępu – od 72,6% dla całej grupy do 96,3% (95% CI: 81,7–99,3%) dla odstępu ≤30 dni.

Typ próbki tkankowej również miał znaczenie. Próbki biopsyjne wykazywały czułość 85,0% (95% CI: 70,9–92,9%) i wartość predykcyjną dodatnią 66,7% (95% CI: 52,9–78,0%), podczas gdy próbki chirurgiczne osiągnęły czułość 63,6% (95% CI: 50,4–75,1%) i wartość predykcyjną dodatnią 85,4% (95% CI: 71,6–93,1%). Wyższa wartość predykcyjna dodatnia dla próbek chirurgicznych wynika prawdopodobnie z większej objętości tkanki nowotworowej, co zwiększa szansę wykrycia wariantów obecnych w ctDNA.

„Nasze wyniki sugerują, że krótszy odstęp między pobraniem próbek znacząco poprawia zgodność sekwencjonowania ctDNA z tkanką, osiągając czułość powyżej 90% zarówno dla biopsji, jak i próbek chirurgicznych przy odstępie ≤30 dni” – piszą autorzy badania.

Czy mutacje w ctDNA przewidują wyniki leczenia atezo/bev?

W grupie 92 pacjentów leczonych atezo/bev w pierwszej linii przeanalizowano znaczenie prognostyczne mutacji TP53 i TERT wykrytych w ctDNA. Obecność mutacji TP53 w ctDNA wiązała się z istotnie krótszym przeżyciem: mediana PFS 4,0 vs. 12,8 miesiąca (p = 0,005) i OS 13,0 miesiąca vs. nieosiągnięta (p = 0,008). Podobnie mutacje TERT w ctDNA korelowały z gorszym rokowaniem: PFS 2,5 vs. 5,6 miesiąca (p = 0,01) i OS 6,4 vs. 22,6 miesiąca (p = 0,002).

Co istotne, mutacje tych genów wykryte wyłącznie w tkance nowotworowej nie wykazywały związku z wynikami klinicznymi (TP53: PFS p = 0,90, OS p = 0,48; TERT: PFS p = 0,54, OS p = 0,88). Analiza stratyfikująca pacjentów na cztery grupy (zgodne, tylko ctDNA, tylko tkanka, brak mutacji) potwierdziła, że gorsze wyniki obserwowano u pacjentów z mutacjami w ctDNA (zarówno zgodnymi, jak i tylko w ctDNA), podczas gdy mutacje wykryte wyłącznie w tkance nie miały znaczenia prognostycznego.

Różnice te mogą wynikać z odstępów czasowych między pobraniami. Dla mutacji TERT, pacjenci z wariantami tylko w tkance mieli znacznie dłuższy odstęp (mediana 315 dni) w porównaniu z grupami ctDNA (20 i 17 dni). Jednak w przypadku TP53, niekorzystne znaczenie prognostyczne mutacji w ctDNA utrzymywało się nawet w podgrupie z odstępem ≤30 dni, co wskazuje, że nie można tego wytłumaczyć jedynie różnicami czasowymi.

Jaka jest rola maxVAF jako biomarkera prognostycznego?

MaxVAF (najwyższa frakcja allelu wariantowego spośród wszystkich wykrytych mutacji w próbce ctDNA) okazał się niezależnym czynnikiem prognostycznym u pacjentów leczonych atezo/bev. W całej grupie atezo/bev mediana maxVAF wynosiła 1,9% (IQR: 0,28–7,71%). Pacjenci z wysokim maxVAF (powyżej mediany) mieli istotnie krótsze przeżycie: PFS 3,5 vs. 9,7 miesiąca i OS 11,0 miesiąca vs. nieosiągnięta (oba p <0,001).

Analiza według kwartyli maxVAF ujawniła progresywne pogorszenie rokowania wraz ze wzrostem maxVAF. Pacjenci w najniższym kwartylu (Q1: 0,0–0,3%) mieli najdłuższą medianę PFS (21,3 miesiąca) i OS (nieosiągniętą), podczas gdy w najwyższym kwartylu (Q4) wyniki były najgorsze (oba p <0,001). Analiza ROC zależna od czasu wskazała optymalne wartości odcięcia maxVAF: 1,01% (6 miesięcy) i 0,35% (12 miesięcy) dla PFS oraz 0,48% (6 miesięcy) i 1,89% (12 miesięcy) dla OS.

W analizie wieloczynnikowej uwzględniającej wiek, płeć, ECOG PS, klasę Child-Pugh, AFP, PIVKA-II, PVTT, rozsiew pozawątrobowy oraz maxVAF według kwartyli, tylko maxVAF pozostał istotnym czynnikiem dla PFS (Q4: HR 3,50; 95% CI: 1,56–7,88; p = 0,002). Dla OS, istotne pozostały ECOG PS (HR 2,32; p = 0,02) i maxVAF (Q4: HR 11,45; 95% CI: 3,13–41,95; p <0,001).

Co więcej, maxVAF zachowywał wartość prognostyczną nawet u pacjentów z prawidłowymi poziomami konwencjonalnych markerów. U pacjentów z prawidłowym AFP (≤8 ng/mL, n=32), wysoki maxVAF wiązał się z krótszym OS (20,0 miesiąca vs. nieosiągnięta, p = 0,03). Podobnie u pacjentów z prawidłowym PIVKA-II (≤40 mAU/mL, n=25), wysoki maxVAF był związany z istotnie krótszym PFS (4,3 miesiąca vs. nieosiągnięta, p = 0,005) i OS (11,8 miesiąca vs. nieosiągnięta, p <0,001).

Jakie są praktyczne konsekwencje dla onkologów?

Badanie to jest największą dotychczas analizą kliniczną ctDNA w zaawansowanym HCC, szczególnie u pacjentów leczonych atezo/bev w pierwszej linii. Wyniki potwierdzają, że ctDNA może stanowić wiarygodną alternatywę dla biopsji tkankowej, szczególnie gdy ta jest niedostępna lub ryzykowna. Klinicznie akceptowalna zgodność (72,6% czułości, 75,0% wartości predykcyjnej dodatniej) wzrasta do >96% przy krótkim odstępie między pobraniami (≤30 dni).

MaxVAF wyłania się jako integracyjny biomarker odzwierciedlający obciążenie nowotworem i heterogenność molekularną. U pacjentów leczonych atezo/bev, maxVAF umożliwia stratyfikację ryzyka niezależnie od tradycyjnych czynników klinicznych i może pomóc w identyfikacji pacjentów wymagających intensywniejszego monitorowania lub alternatywnych strategii terapeutycznych.

Istotne ograniczenia obejmują brak sekwencyjnych próbek ctDNA (tylko przedleczeniowe), co uniemożliwia ocenę dynamiki molekularnej podczas terapii. Ponadto, badanie obejmowało wyłącznie populację wschodnioazjatycką z endemią HBV, co wymaga walidacji w innych grupach etnicznych. Niska zgodność dla CNV (33,3% czułości) odzwierciedla zarówno niską częstość tych zmian w HCC, jak i techniczne ograniczenia detekcji CNV w ctDNA.

„Nasze wyniki podkreślają potencjał ctDNA jako nieinwazyjnej i komplementarnej techniki profilowania genomowego w zaawansowanym HCC, szczególnie gdy sekwencjonowanie tkankowe nie jest wykonalne” – konkludują autorzy.

Co to oznacza dla praktyki klinicznej w leczeniu HCC?

Analiza 130 pacjentów z zaawansowanym HCC wykazała, że ctDNA NGS osiąga klinicznie akceptowalną zgodność z analizą tkankową (czułość 72,6%, wartość predykcyjna dodatnia 75,0%), która wzrasta do >96% przy krótkim odstępie czasowym między pobraniami (≤30 dni). MaxVAF w ctDNA okazał się niezależnym czynnikiem prognostycznym przeżycia u pacjentów leczonych atezo/bev – pacjenci z najwyższym kwartylem maxVAF mieli ponad 11-krotnie wyższe ryzyko zgonu (HR 11,45, p <0,001). Mutacje TP53 i TERT wykryte w ctDNA, ale nie w tkance, wiązały się z gorszym rokowaniem, co sugeruje, że ctDNA lepiej odzwierciedla aktualną biologię guza i jego heterogenność. Badanie potwierdza przydatność ctDNA jako nieinwazyjnego narzędzia w profilowaniu molekularnym HCC, szczególnie gdy biopsja tkankowa nie jest dostępna, oraz wskazuje na maxVAF jako obiecujący biomarker stratyfikacji ryzyka w erze immunoterapii.