Lokalizacja limfocytów CD8⁺ przewiduje odpowiedź na immunoterapię HCC

Czy lokalizacja limfocytów T w guzie przewiduje odpowiedź na immunoterapię?

Rak wątrobowokomórkowy (HCC) pozostaje drugim najbardziej śmiertelnym nowotworem na świecie, z gwałtownie rosnącą zachorowalnością. Kombinacja atezolizumabu (anty-PD-L1) i bewacyzumabu (anty-VEGF) stała się nowym standardem leczenia zaawansowanego HCC, jednak molekularne determinanty odpowiedzi na tę terapię pozostają słabo poznane. Pilnie potrzebne są biomarkery predykcyjne umożliwiające precyzyjne podejście terapeutyczne.

Zespół z Chiba University Hospital przeprowadził retrospektywną analizę próbek biopsyjnych pobranych bezpośrednio przed rozpoczęciem terapii atezolizumabem i bewacyzumabem u 94 pacjentów z zaawansowanym HCC. Badacze wykorzystali immunohistochemię, sekwencjonowanie RNA, cytometrię przepływową oraz obrazowanie multipleksowe, aby szczegółowo scharakteryzować mikrośrodowisko guza (TME) i zidentyfikować cechy predykcyjne odpowiedzi na leczenie. Publikacja ukazała się w JHEP Reports.

Dlaczego gęstość limfocytów CD8⁺ nie wystarczy jako biomarker?

Dotychczasowe badania sugerowały, że pacjenci z istniejącą już odpowiedzią immunologiczną – charakteryzującą się sygnaturami efektorowych limfocytów T i wysoką gęstością komórek CD8⁺ – lepiej odpowiadają na atezolizumab i bewacyzumab. Jednak translacja tych obserwacji na klinicznie użyteczne biomarkery pozostaje wyzwaniem.

Problem polega na tym, że większość badań wykorzystuje archiwalne próbki z momentu pierwotnej diagnozy, gdy kombinowana immunoterapia nie jest jeszcze wskazana. Tymczasem mikrośrodowisko guza może ulec znaczącej ewolucji, zanim choroba postąpi do stadium wymagającego tego rodzaju leczenia. Aby pokonać te ograniczenia, autorzy opracowali bezpieczny protokół pobierania próbek tuż przed rozpoczęciem terapii atezolizumabem i bewacyzumabem.

Kluczowe pytanie brzmiało: czy efektorowe limfocyty CD8⁺ oraz efektorowe regulatorowe limfocyty T (eTreg) mogą służyć jako predyktory odpowiedzi na kombinowaną immunoterapię w zaawansowanym HCC? Ponadto, czy te cechy immunologiczne można powiązać z cechami patologicznymi dostępnymi w rutynowej praktyce klinicznej?

Jak badano mikrośrodowisko guza w zaawansowanym HCC?

Badanie obejmowało dwie niezależne grupy pacjentów z zaawansowanym HCC leczonych atezolizumabem i bewacyzumabem w Chiba University Hospital. Grupa wyznaczająca składała się z 94 pacjentów leczonych między październikiem 2020 a grudniem 2022, natomiast grupa walidacyjna obejmowała 25 pacjentów leczonych między styczniem 2023 a grudniem 2024.

Biopsje guza wykonywano bezpośrednio przed rozpoczęciem terapii atezolizumabem i bewacyzumabem. Z 94 pacjentów uzyskano próbki nadające się do oceny patologicznej od 81 osób. Immunohistochemia CD8 była wykonana u 77 pacjentów, sekwencjonowanie RNA u 63, cytometria przepływowa dla CD8⁺ T-komórek u 53 oraz dla eTreg u 44 pacjentów. Obrazowanie multipleksowe przeprowadzono u 13 osób.

Różnice w liczbie próbek odzwierciedlają ograniczoną ilość materiału biopsyjnego oraz jego stopniową alokację pomiędzy różne platformy analityczne. Pomimo tych ograniczeń – typowych dla badań zaawansowanego HCC, gdzie resekcja guza często nie jest możliwa – analiza wieloplatformowa dostarczyła cennych danych immunologicznych.

Jakie cechy immunologiczne decydują o odpowiedzi na leczenie?

Analiza molekularna i immunologiczna ujawniła rozkład klas immunologicznych (inflamed vs non-inflamed) zgodny z wcześniejszymi doniesieniami, mimo że badano zaawansowane stadium choroby. Sygnatura inflamed silnie korelowała z gęstością CD8⁺ T-komórek oraz wzbogaceniem wcześniej opisanych sygnatur immunologicznych.

Kluczowym odkryciem było jednak to, że ani odsetek PD-1+ w CD8⁺ T-komórkach, ani obecność eTreg nie wykazywały istotnej korelacji z sygnaturą inflamed. Co więcej, te parametry immunologiczne nie korelowały z charakterystyką kliniczną pacjentów, w tym z poziomem AFP (alfa-fetoproteiny) w surowicy.

Analiza przeżycia wolnego od progresji (PFS) wykazała, że wysoki odsetek PD-1+ w CD8⁺ T-komórkach był silnie związany z korzystnym PFS (HR 0,24; 95% CI: 0,11–0,52; p<0,001). Ten związek pozostał istotny po uwzględnieniu potencjalnych zmiennych prognostycznych, co potwierdza rolę PD-1+ w CD8⁺ T-komórkach jako niezależnego predyktora odpowiedzi.

Co istotne, PD-1+ w CD8⁺ T-komórkach był znacząco wyższy zarówno w grupie z kontrolą choroby (p=0,049), jak i w grupie z korzyścią kliniczną (p=0,003). W przeciwieństwie do tego, ani gęstość CD8⁺ T-komórek (HR 1,12; p=0,156), ani wcześniej opisywane sygnatury immunologiczne nie wykazywały istotnego związku z wynikami klinicznymi.

Czy lokalizacja limfocytów T ma większe znaczenie niż ich liczba?

Wysoki odsetek PD-1+ w CD8⁺ T-komórkach wiązał się z korzystnym PFS niezależnie od gęstości CD8⁺ T-komórek. To skłoniło badaczy do zbadania mechanizmów leżących u podstaw skuteczności terapii w dwóch kontrastujących warunkach: dlaczego niektórzy pacjenci wykazywali słabą odpowiedź mimo wysokiej gęstości CD8⁺ T-komórek, a inni osiągali korzystną odpowiedź nawet przy niskiej gęstości tych komórek?

Analiza obrazowania multipleksowego ujawniła, że próbki z niskim odsetkiem PD-1+ w CD8⁺ T-komórkach wykazywały mniej interakcji między limfocytami CD8⁺ a komórkami nowotworowymi, ale więcej interakcji między CD8⁺ T-komórkami a fibroblastami w porównaniu z próbkami z wysokim PD-1+. Ilościowa analiza przestrzenna potwierdziła, że limfocyty CD8⁺ u pacjentów z niskim PD-1+ znajdowały się znacząco dalej od komórek nowotworowych (p<0,001) i bliżej fibroblastów (p<0,001).

W próbce od pacjenta z wysokim PD-1+ w CD8⁺ T-komórkach limfocyty te były zlokalizowane głównie w parenchymie guza, podczas gdy u pacjenta z niskim PD-1+ znajdowały się przede wszystkim w zrębie włóknistym. Te obserwacje skłoniły do systematycznej oceny wzorców lokalizacji CD8⁺ T-komórek w większej grupie.

Analiza histologiczna 77 próbek biopsyjnych wykazała, że 54 przypadki (70%) prezentowały wzorzec dominacji parenchymy guza (tumor parenchyma-predominant), a 23 (30%) – dominacji zrębu włóknistego. Pacjenci z wzorcem dominacji parenchymy wykazywali lepszą odpowiedź na atezolizumab i bewacyzumab oraz wyższy odsetek PD-1+ w CD8⁺ T-komórkach. Ten związek utrzymywał się nawet u pacjentów z wysoką gęstością CD8⁺ T-komórek.

Badacze zidentyfikowali również kilka genów matrysomu – w tym MATN2, THSD4 i LGALS3 – które wykazywały ujemną korelację z odsetkiem PD-1+ w CD8⁺ T-komórkach. Szczególnie interesujący jest LGALS3 kodujący galektynę-3, białko znane z hamowania limfocytów CD8⁺ i aktywacji fibroblastów.

Difuzny rozkład limfocytów CD8⁺ – nowy marker predykcyjny?

Badacze przeanalizowali również przestrzenny rozkład CD8⁺ T-komórek w obrębie parenchymy guza, klasyfikując go jako difuzny lub zlokalizowany. Difuzny rozkład definiowano jako obecność co najmniej trzech limfocytów CD8⁺ w całej ciągłej parenchymie guza w polu dużego powiększenia, podczas gdy rozkład zlokalizowany nie spełniał tego kryterium.

Spośród 77 ocenionych przypadków, 38 wykazywało difuzny rozkład, a 39 – zlokalizowany. Pacjenci z difuznym rozkładem CD8⁺ T-komórek w parenchymie guza wykazywali zarówno lepszą odpowiedź na atezolizumab i bewacyzumab, jak i wyższy odsetek PD-1+ w CD8⁺ T-komórkach. Co istotne, ten związek utrzymywał się nawet u pacjentów z niską gęstością CD8⁺ T-komórek.

Analiza obrazowania multipleksowego wykazała, że pacjenci ze zlokalizowanym rozkładem CD8⁺ T-komórek wykazywali więcej interakcji między limfocytami CD8⁺ a fibroblastami. Ilościowa ocena przestrzenna potwierdziła, że limfocyty CD8⁺ i fibroblasty znajdowały się znacząco bliżej siebie w przypadku zlokalizowanego rozkładu.

Integrując te dwie cechy przestrzenne – preferencyjna lokalizacja CD8⁺ T-komórek w parenchymie guza oraz ich difuzny rozkład – badacze zidentyfikowali grupę pacjentów o najlepszym rokowaniu. Osoby, których guzy wykazywały obie korzystne cechy, częściej miały wysoki odsetek PD-1+ w CD8⁺ T-komórkach (83%) i osiągały najdłuższą medianę PFS wynoszącą 14,3 miesiąca (log-rank p=0,019). W porównaniu z resztą grupy, pacjenci z obiema korzystnymi cechami mieli zredukowane ryzyko progresji (HR 0,37; 95% CI: 0,19–0,73).

Co ważne, te wzorce infiltracji nie wykazywały wyraźnego związku z podwyższonym poziomem AFP (>400 ng/ml), co sugeruje ich niezależną wartość predykcyjną. Wyniki te zostały potwierdzone w niezależnej grupie walidacyjnej 25 pacjentów, gdzie osoby z obiema korzystnymi cechami przestrzennymi również wykazywały trend w kierunku poprawy PFS (HR 0,12; 95% CI: 0,00–0,94; p=0,047).

Jak bewacyzumab wpływa na równowagę immunologiczną w guzie?

W przeciwieństwie do wyników dotyczących limfocytów CD8⁺, wartość predykcyjna odsetka PD-1+ w efektorowych regulatorowych limfocytach T (eTreg) różniła się od wcześniejszych doniesień dotyczących innych typów nowotworów. Autorzy przypisują to obecności bewacyzumabu w schemacie terapeutycznym, ujawniając nową interakcję mechanistyczną między terapiami anty-VEGF i anty-PD-L1.

Badacze przeanalizowali pacjentów, u których przerwano bewacyzumab z powodu działań niepożądanych (głównie białkomocz), kontynuując monoterapię atezolizumabem. Wśród tych pacjentów osoby z wysokim odsetkiem PD-1+ w eTreg wykazywały trend w kierunku krótszego czasu do progresji choroby po przerwaniu bewacyzumabu.

Analiza obrazowania multipleksowego sparowanych próbek (wyjściowa i po progresji) ujawniła znaczący wzrost odsetka PD-1+ w limfocytach Treg u pacjenta, który progresował po przejściu na monoterapię atezolizumabem. Analiza wzbogacania zestawów genów (GSEA) wykazała, że kluczowe szlaki związane z aktywnością przeciwnowotworową układu immunologicznego – w tym odpowiedź na interferon-gamma – były wyraźnie stłumione w momencie progresji u pacjentów po przerwaniu bewacyzumabu.

Badania in vitro potwierdziły te obserwacje kliniczne. Jednojądrzaste komórki krwi obwodowej traktowane samym atezolizumabem wykazywały zwiększoną ekspresję markerów aktywacji eTreg, w tym PD-1, CTLA-4, ICOS i GITR. Dodanie bewacyzumabu hamowało ekspresję tych markerów aktywacji, wspierając hipotezę, że bewacyzumab łagodzi aktywację eTreg indukowaną przez blokadę PD-L1.

“Nasze wyniki sugerują, że bewacyzumab może przeciwdziałać potencjalnie niekorzystnym efektom blokady PD-L1 poprzez hamowanie aktywacji efektorowych regulatorowych limfocytów T” – piszą autorzy badania. To odkrycie rozszerza nasze rozumienie mechanizmów działania kombinowanych immunoterapii w HCC i podkreśla znaczenie utrzymania bewacyzumabu w schemacie terapeutycznym.

Czy możemy lepiej przewidywać odpowiedź na atezolizumab i bewacyzumab w HCC?

Badanie dostarcza dwóch głównych odkryć dotyczących leczenia zaawansowanego HCC kombinacją atezolizumabu i bewacyzumabu. Po pierwsze, konwencjonalna ocena histologiczna charakterystyki przestrzennej limfocytów CD8⁺ – obejmująca ich lokalizację i wzorzec rozmieszczenia w parenchymie guza – może służyć jako predyktor skuteczności leczenia. Jest to łatwe do zastosowania narzędzie umożliwiające bardziej świadome podejmowanie decyzji klinicznych. Po drugie, badacze odkryli nowy mechanizm synergii w schemacie atezolizumab-bewacyzumab, w którym hamowanie aktywacji eTreg przez bewacyzumab wzmacnia skuteczność blokady PD-L1. Te ustalenia nie tylko dostarczają ram dla selekcji pacjentów opartej na biomarkerach, ale również oferują wgląd mechanistyczny, który może pomóc w projektowaniu przyszłych kombinacji immunoterapii dla zaawansowanego HCC. Autorzy podkreślają jednak, że jest to analiza eksploracyjna bez bezpośrednich konsekwencji dla obecnej praktyki klinicznej – przyszłe badania powinny potwierdzić te wyniki w zewnętrznych grupach pacjentów.